Rapid characterization of avian reoviruses using phylogenetic analysis, reverse transcription-polymerase chain reaction and restriction enzyme fragment length polymorphism

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Abstract
A reverse transcription-polymerase chain reaction is described, which amplified the full-length σC-encoding and σNS-encoding genes of avian reovirus (ARV). DNA fragments of 1022 and 1152 base pairs were amplified among ARV isolates, respectively, indicating that there were no apparent deletions or insertions in these regions. Fragments amplified from vaccine strains and field isolates were digested with five different restriction enzymes Bcn I, Hae III, Taq I, Dde I, and Hinc II, respectively. Restriction fragment profiles observed on polyacrylamide gels showed heterogeneity between vaccine and Taiwanese isolates. All ARV isolates tested showed different restriction enzyme cleavage patterns and could be clearly distinguished. The strain-typing based on the cleavage sites in the σC-encoding gene of ARV showed that viruses could be classified into four distinct groups. A phylogenetic tree based on the nucleotide sequences of the σC-encoding gene revealed that Taiwanese ARV isolates were classified into four distinct groups, indicating that the genotyping is consistent with typing based on restriction enzyme fragment length polymorphism of the σC-encoding gene of ARV. The results suggested that polymerase chain reaction followed by restriction enzyme analysis provided a simple and rapid approach for characterization of ARV isolates. Also, it is possible to determine whether a new variant strain has been introduced into a flock or a given virus strain has spread from one flock to another. Résumé Caractérisation rapide des réovirus aviaires en utilisant l'analyse phylogénétique, l'amplification en chaîne par polymérase et le polymorphisme de taille des fragments de restrictionUne méthode de transcription reverse et d'amplification en chaîne par polymérase (RT-PCR) qui amplifie toute la longueur des gènes codant σC et σNS des réovirus aviaires (ARV) est décrite. Les fragments d'ADN de 1022 et 1152 paires de bases ont été amplifiés parmi les souches ARV isolées indiquant qu'il n'y avait pas de délétions apparentes ou d'insertions au niveau de ces régions. Les fragments amplifiés à partir des souches vaccinales et celles isolées du terrain ont fait l'objet de digestion avec cinq différentes enzymes de restriction Bcn I, Hae III, Taq I, Dde I, et Hinc II. Les profils des fragments de restriction observés sur gel de polyacrylamide ont montré une hétérogénéité entre les souches terrain taiwanaises et les vaccins. Tous les ARV, isolés du terrain, testés, ont présenté des profils de restriction enzymatique différents et peuvent être distingués clairement. Le typage des souches, basé sur les sites de clivage du gène codant σC des ARV, a montré que les virus pouvaient être classés en 4 groupes. L'arbre phylogénétique, basé sur la séquence nucléotidique du gène codant σC, a montré que les souches terrain taiwanaises d'ARV étaient classées en 4 groupes, indiquant que le génotypage était en accord avec le typage basé sur le polymorphisme de taille des fragments de restriction (RFLP) du gène codant σC des ARV. Ces résultats suggèrent que la PCR suivie d'une analyse de restriction enzymatique apporte une approche simple et rapide de la caractérisation des souches terrain d'ARV. Ainsi, il est possible de déterminer si une nouvelle souche variante a été introduite dans un troupeau ou si une souche de virus a diffusé d'un troupeau à un autre. Zusammenfassung Schnelle Charkterisierung von aviären Reoviren mittels phylogenetischer Analyse, Reverse Transkriptase-Polymerasekettenreaktion und RestriktionsenzymfragmentlängenpolymorphismusEine Reverse Transkriptase-Polymerasekettenreaktion (RT-PCR), die die Gesamtlänge der σC-und σNS-kodierenden Gene des aviären Reovirus (ARV) amplifiziert, wird beschrieben. Bei verschiedenen ARV-Isolaten wurden DNS-Fragmente von 1022 bzw. 1152 Basenpaaren wurden amplifiziert. Es zeigten sich keine offensichtlichen Deletionen oder Insertionen in diesen Regionen. Aus Vakzine- und Feldstämmen amplifizierte Fragmente wurden mit fünf verschiedenen Restriktionsenzymen (Bcn I, Hae III, Taq I, Dde I und Hinc II) verdaut. Die auf Polyacrylamidgelen zu beobachtenden Restriktionsfragmentprofile ließen eine Heterogenität zwischen den Vakzinestämmen und den taiwanesischen Isolaten erkennen. Alle untersuchten ARV-Isolate wiesen verschiedene Restriktionsenzymspaltungsmuster auf und konnten deutlich unterschieden werden. Die auf den Spaltungsstellen im σC-kodierenden ARV-Gen basierende Stammtypisierung zeigte, dass die Viren in vier unterschiedliche Gruppen klassifiziert werden konnten. Ein auf der Basis der Nukleotidsequenzen des σC-kodierenden Gens erstellter phylogenetischer Baum ließ erkennen, dass die taiwanesischen ARV-Isolate ebenfalls in vier verschiedene Gruppen eingeordnet wurden, was darauf hin weist, dass die Genotypisierung mit der Typisierung übereinstimmt, die auf dem Restriktionsenzymfragmentlängenpolymorphismus (RFLP) des im σC-kodierenden ARV-Gens basiert. Die Ergebnise legen nahe, dass die PCR mit nachfolgender Restriktionsenzymanalyse eine einfache und schnelle Methode zur Charakterisierung von ARV-Isolaten darstellt. Ebenso ist es mögich festzustellen, ob eine neuer Variantstamm in einer Herde aufgetreten ist oder ein bekannter Virusstamm sich von einer auf eine andere Herde ausgebreitet hat.Caracterización rápida de los reovirus aviares mediante análisis filogenético, transcripción reversa- reacción en cadena de la polimerasa, y polimorfismo de la longitud de los fragmentos de restricción enzimática Resumen Caracterización rápida de los reovirus aviares mediante análisis filogenético, transcripción reversa- reacción en cadena de la polimerasa, y polimorfismo de la longitud de los fragmentos de restricción enzimáticaSe describe una técnica de transcripción reversa- reacción en cadena de la polimerasa (RT-PCR), que amplifica en su totalidad los genes σC- y σNS- codificantes de los reovirus aviares (ARV). Se amplificaron fragmentos de DNA de 1022 y 1152 pares de bases respectivamente a partir de los aislamientos de ARV, lo que indica que no hay deleciones o inserciones aparentes en estas regiones. Los fragmentos amplificados de cepas vacunales y aislamientos de campo se digirieron con cinco enzimas de restricción diferentes Bcn I, Hae III, Taq I, Dde I, and Hinc II, respectivamente. Los patrones de los fragmentos de restricción observados en geles de poliacrilamida mostraron heterogeneicidad entre los aislamientos vacunales y de taiwaneses. Todos los aislamientos de ARV analizados mostraron diferentes patrones de corte de las enzimas de restricción, y podían distinguirse claramente. La tipificación de cepas basada en los lugares de corte en el gen σC-codificante de los ARV mostró que los virus se podían clasificar en cuatro grupos distintos. El árbol filogenético basado en las secuencias nucleotídicas del gen σC-codificante reveló que los aislamientos de ARV de Taiwan se clasificaban en cuatro grupos distintos, lo cual indica que la genotipificación es consistente con la tipificación basada en el polimorfismo de la longitud de los fragmentos de los enzimas de restricción (RFLP) del gen σC-codificante de los ARV. Los resultados sugirieron que la PCR seguida del análisis de la restricción enzimática permitía una simple y rápida aproximación para la caracterización de los aislamientos de ARV. También, que es posible determinar si una nueva cepa variante se ha introducido en una manada o una cepa vírica ya presente se ha diseminado de una manada a otra.