Effect of Cyclandelate on Prostacyclin Release and Cytosolic Free Calcium Concentrations in Human Endothelial Cells

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Abstract
An increase in the concentration of cytosolic calcium plays a pivotal role in the stimulation of endothelial cells to release various mediators that are involved in vasodilatation and haemostasis. When these cells become damaged, a larger irreversible influx of calcium ions can cause ‘calcium overload’ and cell death. Cyclandelate may affect the influx of calcium ions in cells and act as a calcium overload blocker. Therefore, the effects of cyclandelate on prostacyclin (PGI2) release and cytosolic free calcium were investigated in cultured human endothelial cells. Cyclandelate did not inhibit the production of 6-keto-PGF1a, a stable metabolite of prostacyclin. Similarly, cyclandelate (10−6 to 10−4 mol/L) and flunarizine (10−6 to 10−5 mol/L) had no effect on the increased concentrations of cytosolic free calcium in cells stimulated by bradykinin or thrombin, or on non-stimulated cells as evaluated with the calcium indicator fura- 2. This was found both in serum- free conditions and in the presence of 10% human serum. It is likely that the rise in cytosolic free calcium concentration upon stimulation of cultured human endothelial cells depends on the influx of calcium ions from an intracellular storage pool. Une augmentation des taux cytoplasmiques de calcium joue un rôle clé dans la stimulation des cellules endothéliales pour libérer certains médiateurs impliqués dans les processus de la vasodilatation et de l’hémostase. En cas de lésions de ces cellules, une importante et irréversible entrée d’ions calcium est susceptible de provoquer une «surcharge calcique» et la mort de la cellule. Le cyclandélate peut influer sur le transport intra-cellulaire des ions calcium et agir comme un inhibiteur de la surcharge calcique. En conséquence, l’auteur a étudié les effets du cyclandélate sur la libération de prostacycline (PGI2) et sur les taux cytosoliques de calcium libre dans des cellules endothéliales humaines en culture. La cyclandélate n’a pas inhibé la production de 6-céto-PGFla, métabolite stable de la prostacycline. De même, le cyclandélate (10−6 à 10−4 mol/l) et la flunarizine (10−6 à 10−5 molli) n’ont eu aucune action sur les concentrations cytoplasmiques élevées du calcium libre de cellules stimulées par la bradykinine ou la thrombine ou de cellules non stimulées, évaluées par le marqueur calcique fura-2. Ces résultats se sont vérifiés tant en présence de sérum humain à 10% qu’en l’absence de sérum. Il est donc vraisemblable que l’augmentation des concentrations cytoplasmiques de calcium libre à la suite d’une stimulation de cellules endothéliales humaines en culture est sous la dépendance de l’entrée d’ions calcium provenant d’une réserve intra-cellulaire. Un aumento délia concentrazione del calcio citoplasmatico ha un ruolo cardinale sulla stimolazione délie cellule endoteliali e sulla liberazione dei vari mediatori che sono responsabili della vasodilatazione e dell’emostasi. Quando queste cellule sono danneggiate, un maggiorflusso verso l’interno, irreversibile, di ioni calcio può causare un sovraccarico di calcio e morte délie cellule. Il ciclandelato può influenzare il flusso degli ioni calcio verso l’interno delle cellule e agire come un bloccante del sovraccarico del calcio. Furono perciò studiati, nette colture di cellule endoteliali umane, gli effetti del ciclandelato sulla liberazione della prostaciclina (PGI2) e sul calcio libero citosolico. Il ciclandelato non inibiva la produzione délia 6-cheto PGF1a, un metabolita stabile della prostaciclina. In modo analogo il ciclandelato (da 10−6 a 10−4 mol/l) e la flunarizina (da 10−6 a 10−4 mol/l) non avevano effetto sull’aumento del calcio libero citoplasmatico sia nette cellule stimolate da bradichinina o trombina, sia nette cellule non stimolate. Il livello di Ca2+ (concentrazione citoplasmatica) era valutato con il fura-2, indicatore del calcio. La misura è stata effettuata sia in condizioni di assenza di siero che in presenza del 10% di siero umano. È perciò probabile che l’aumento della concentrazione del calcio libero citoplasmatico, per stimolazione dette cellule endoteliali umane in coltura, dipenda dalflusso di ioni calcio da un pool di accumulo intracellulare. Een toename van de concentratie van calcium in het cytosol speelt een hoofdrol bij de stimulatie van de endotheelcellen tot vrijmaking van verscheidene mediatoren die betrokken zijn bij vasodilatatie en hemostase. Als die endotheelcellen beschadigd worden, kan het irreversibele binnenstromen van calciumionen in de cellen leiden tot een “calciumoverbelasting” en celdood. Cyclandelaat kan die influx van calciumionen in de cellen beïnvloeden en fungeren als een “calcium overload blocker”. Daarom werden de effecten van cyclandelaat op de vrijkoming van prostacycline (PG12s) en vrij calcium in het cytosol onderzocht bij gekweekte humane endotheelcellen. Cyclandelaat had geen invloed op de produktie van 6-keto-PGF11a, een stabiele metaboliet van prostacycline. Cyclandelaat (10−6 tot 10−4 mol/l) en flunarizine (10−6 tot 10−5 mol/l) hadden evenmin enig effect op de verhoogde concentraties van vrij calcium in het cytosol van gestimuleerde cellen, zoals geëvalueerd werd met de calciumindicator fura-2. Dit resultaat bereikte men zowel in serumvrije omstandigheden als bij de aanwezigheid van 10 % menselijk serum. Het is daarom aannemelijk dat de stijging van het gehalte aan vrij calcium in cytosol na stimulatie van humane endotheelcellen in cultuur afhangt van de influx van calciumionen vanuit een intracellulair depot.