Expression von AC133 vs. CD34 bei akuten Leukämien im Kindesalter*

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Abstract
AC133, ein neu entdecktes Stammzellantigen mit 5-transmembranen Domänen wird von 30 - 60 % aller CD34+-Zellen exprimiert. Wir haben uns daher zum Ziel gesetzt, zu untersuchen, ob und in welchem Ausmaß humane Stamm-/Progenitorzellen (HSPZ) des Nabelschnurblutes (NSB) sowie des peripheren Blutes (PB) vor oder nach G-CSF-Stimulation AC133 exprimieren. Schwerpunktmäßig haben wir Knochenmark-(KM)-Proben von akuten Leukämien zum Zeitpunkt der Erstdiagnose im Rezidiv und auch während einer kompletten Remission analysiert. Die Expressionsanalysen wurden flowzytometrisch durchgeführt, wobei spezifische monoklonale Antikörper (AC133/1 und AC133/2 der Fa. Miltenyi Biotec GmbH) in Kombination mit dem Antikörper gegen CD34 (HPCA-2 der Fa. Becton Dickinson) verwendet wurden. In bisherigen Untersuchungen haben wir im NSB von 43 Proben einen durchschnittlichen Anteil von 0,294 ± 0,165 % AC133+- vs. 0,327 ± 0,156 % CD34+-HSPZ gemessen. Im PB von 11 Probanden konnten max. 0,15 % CD34+- und auch AC133+-HSPZ nachgewiesen werden. Deutlich höher lag die Stammzellkonzentration im PB von Kindern mit unterschiedlichen Erkrankungen (Neuroblastom, Rhabdomyosarkom, ALL/AML), die für eine periphere Blutstammzelltransplantation (PBSZT) mit rhG-CSF vorbereitet worden waren. Es konnten bis zu 3,51 % AC133+-Zellen ermittelt werden, geringfügig höhere Werte (3,94 %) wurden für CD34+ festgestellt. An insgesamt 128 KM-Proben haben wir AC133+- als auch CD34+-Zellen quantifiziert. 10 von diesen KM-Proben stammten von Patienten, bei denen eine Neoplasie nicht nachgewiesen werden konnte. Die CD34+-Zellen lagen zwischen 0,03 - 1,49 %; etwas geringer (bis 0,64 %) waren die Werte für AC133. KM-Proben von 53 Kindern mit akuter Leukämie wurden bei Erstdiagnose (41 ALL/12 AML) phänotypisiert und die Leukämieblasten auf AC133- und CD34-Expression überprüft. 32/41 (78 %) der lymphatischen Leukämieblasten waren CD34-positiv und 24/41 (58 %) exprimierten AC133. Interessanterweise konnten wir bei zwei Proben von ALL-Patienten eine AC133-Expression feststellen, jedoch keine CD34-Antigene. 42 % (5/12) der AML-Blasten exprimierten CD34 und nur 25 % (3/12) das Antigen AC133. Ähnliche Werte erhielten wir in der Rezidivgruppe (n=18). In der Gruppe der Leukämien, bei denen zum Zeitpunkt der Untersuchung eine Remission vorlag (n=47), konnten bis zu 5,55 % CD34+- und bis zu 1,25 % AC133-positive HSPZ ermittelt werden. Diese relativ hohen Werte dürften auf eine z. T. bestehende rhG-CSF-Stimulation zur rascheren Überwindung einer Aplasie zurückzuführen sein. Aus unseren bisherigen Ergebnissen folgern wir, dass es sinnvoll erscheint, Quantifizierungen von CD34+-HSPZ durch den Nachweis von AC133 zu ergänzen. Dieser neue Stammzellmarker könnte im Rahmen einer autologen PBSZT als eine mögliche Alternative zu CD34 bei Verwendung einer MACS-Selektion in Betracht gezogen werden. AC133-negative Leukämien könnten im Falle eines unzureichenden Ansprechens auf die protokollgemäße Chemotherapie ebenfalls von einer PBSZT profitieren. Abkürzungen: AA Aplastische Anämie ALL Akute Lymphoblastische Leukämie AML Akute Myeloische Leukämie CD Cluster of Differentiation HSPZ Hämatopoetische Stamm- u. Progenitor-Zellen KM Knochenmark MNZ Mononukleäre ZellennAnzahl NSB Nabelschnurblut PB Peripheres Blut PBSZT Periphere Blutstammzell-Transplantation rhG-CSF rekombinanter humaner Granulozyten-Kolonie-Stimulierender Faktor AC133, a newly discovered antigen on human progenitor cells, demonstrating 5-transmembraneous domains is expressed by 30 - 60 % out of all CD34+ cells. Our aim therefore was to investigate the extent of human stem-/progenitor cells expressing AC133 antigen in umbilical cord blood, peripheral blood without or following an application of granulocyte-colony stimulating factor (rhG-CSF). The main task was the investigation of bone marrow aspirates derived from children suffering from newly diagnosed acute leukemias, as well as from patients with a relapse or during a complete remission. The determination of antigen expression was done by application of flow cytometry (FACScan analysis) and the usage of newly developed monoclonal antibodies (AC133/1 and AC133/2; Miltenyi Biotec GmbH) in combination with monoclonal antibody directed against CD34-antigens (HPCA-2; BD). Our studies till now show average percentages in umbilical cord blood derived from 43 newborns about 0.294 ± 0.165 % AC133+ vs. 0.327 ± 0.156 % CD34+ hematopoietic stem-/progenitor cells (HSPC). In peripheral blood from 11 healthy donors we verified up to 0.15 % CD34+ as well as AC133+ HSPC's. The concentration of progenitor cells was found to be obviously higher in peripheral blood from children with various diseases (neuroblastoma, rhabdomyosarcoma, ALL/AML) and undergoing application with rhG-CSF in order to be prepared for PBSC-transplantation. In those cases we found up to 3.51 % AC133+ cells as well as slightly higher values (3.94 %) for CD34 antigens. Additionally we quantified 128 bone marrow (BM) samples for AC133+ and CD34+ cells. In 10 BM samples, derived from patients without any neoplasia, the CD34+ cells were about 0.03 % and 1.49 %, whereas AC133 values were up to 0.64 %. Bone marrow aspirates from 53 children with acute leukemias at time of diagnosis (ALL: n=41/AML: n=12) have been immunophenotyped and leukemic blast cells have been proved for AC133- and CD34 antigen expression. 32/41 (78 %) of lymphoblastic leukemic cells showed to be positive for CD34 antigen and 24/41 (58 %) demonstrated AC133 antigens....

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