Factors affecting the accuracy of chlorophylla andb determination by means of their paper chromatographic separation and colorimetric measurement in eluates

Publisher Website
Google Scholar
Abstract
Quantitative determination of chlorophyll a and β can be made by paper chromatography of acetone extracts of plant material with colorimetric measurement of the eluates from the separated zones. From the suitable solvent systems which give adequate separation of the pigments at a distance of 20 cm. from the start,Hager's mixture (1955) separates the chlorophylls better than the toluene-isopropanol (400: 1 v/v.) mixture, which, however, is better for the separation of carotenoids. Twice the amount of chlorophyll is separated on Whatman 31 ET paper, equally well and with the same time of development, as on Whatman No. 3 paper, on which it is possible to separate a maximum of about 15 μg of chlorophyll pigments per 1 em. start length. Losses on elution are, however, higher on using Whatman 31 ET paper. In plants with a high chlorophyllase activity, the error of determining chlorophyll a andb is greatly reduced if the leaves are placed for 1 min. in boiling water before extraction. For elution of chlorophylla andb from paper it is better to use anhydrous acetone, for chlorophyllides 80% acetone. A comparison of the procedure investigated with the method of two-wave length spectrophotometric measurement of crude acetone extracts showed that in view of the average 10% loss, the chromatographic method is hardly suitable for determining the absolute amounts of chlorophylla andb, although the relation (a/b) can be determined with similar precision by both methods. Moreover, in view of the greater amount of work involved the chromatographic method can only be recommended for confirming the results of spectrophotometrie determination. Quantitative determination of chlorophylls from the area of the spot or from the "RF" value can only be of an informative character. Ke stanovení množství chlorofylůa ab lze též použít papírové chromatografie acetonových extraktů z rostlinného materiálu s kolorimetrickým měřením eluátů z oddělených zón. Z vhodných rozpouštědlových soustav, které dostatečně rozdělí pigmenty již asi na 20 cm délce papíru, dokonaleji oddělí od sebe chlorofyly Hagerova (1955) směs než soustava toluen-isopropanol (400: 1 obj.), vhodnější naopak pro dělení karotenoidů. Na papíře Whatman 31 ET se za stejnou dobu vyvíjení stejně dobře oddělí asi dvojnásobná množství chlorofylů než na papíře Whatman 3, na kterém lze maximálně oddělit asi 15 ⧎g chlorofylových pigmentů na 1 cm délky startu. Ztráty při eluci jsou však vyšší při použití papíru Whatman 31 ET. U rostlin s vysokou aktivitou chlorofylázy chybu stanovení chlorofylůa ab značně snížíme, ponoříme-li listy před extrakcí na 1 min. do vařící vody. K eluaci chlorofylůa ab z papírů je lépe použít bezvodého acetonu, k eluci chlorofylidů 80% acetonu. Srovnání sledovaného postupu s metodou dvouvlnového spektrofotometriekého měření surového acetonového extraktu prokázalo, že vzhledem k průměrně 10% ztrátám je chromatografická metoda málo vhodná pro stanovení absolutního množství chlorofylůa ab, i když vzájemný poměr jejich množství určíme oběma metodami s obdobnou přesností. Také vzhledem k větší pracovní náročnosti lze chromatografickou metodu doporučit pouze k ověřování výsledků metody spektrofometrické. Цля опрецеления количества хлороϕиллов а и б возможно также пользоваться Хрматограϕией на бумаге ацетоновых из зкстрактов из растителвного материала с колориметрическим измерением эллюатов иэ отдельных эон Иэ снстем растворителей, которые достаточно раэделяют нигмелты уже иа 20-сантиметровон длине бумоги, лучше раэделяет хлороϕиллы смесь Гагера (1995) по сравиениыс системой толуол- иэопропанол (400:1), коорая, наоборот, для раэделения каротеноидов. На бумаге Ватман 31 ЭТ эа тот же промежуток врсмени одинаково хорошо разделится двукратное колнество хлороϕиллов по сравнению с бумагой Ватман З, на которой воэможно максималвно разделить приблиэительно 15 мг хлороϕлловых пигментов на 1 см длины старта.Потери во время эллюции, однако, выше по сравнению с испольэованием бумаги Ватман 31 ЭТ.У растений с высокой активностью хлороϕиллазы ошибку определения хлороϕиллов а б эначительно снизит опускание листьевдо экстрагирования в кипячую воду на срок 1 мин. Для эллюции хлороϕиллв а и б иэ бумаги лучше всео использовать обезвоженный ацетн, для эллюции хлороϕиллидов 80% ацетон. Сопоставление приведенного способос методом двухволнового спектроϕотометриче ского измерения сырого ацетонового экстракта показало, что - смотря на в среднем 10% потери- хроматограϕический метод мало подходит для определения аболюного количества хлороϕиллов а и б, хотя и их взаимное соотношение обоими методами определим со сходной точностью. Также в связи с Большей трудоемкостью следует хроматограϕический метод рекомндовать только для проверки результатов спектроϕотометриче ского метода.