Kinetische Mikrobestimmung von Nucleosid- Triphosphaten in der Glucose-1-Phosphat-Kinase/Phosphoglucomutase-Reaktion

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Abstract
Die von Glucose-1-Phosphat-Kinase (G1PK) katalysierte Phosphorylierung von Glucose-1-Phosphat (G1P) zu Glucose-1,6-Diphosphat (G16P) wird mit der Phosphoglucomutase- (PGM) Reaktion zu einer quantitativen Mikrobestimmung von ATP und anderen Nucleosid-Triphosphaten kombiniert. Das in der G1PK-Reaktion stöchiometrisch aus Nucleosid-Triphosphat und G1P gebildete G16P wird im kinetischen Test über die Beschleunigung der PGM gemessen. In Gegenwart von G1PK und definierten Konzentrationen von ATP werden identische Beschleunigungswerte der PGM-Reaktion gemessen wie allein in Anwesenheit entsprechender Konzentrationen von synthetischem G16P. G1PK ist nicht spezifisch für ATP. GTP, ITP, CTP und UTP werden gleichfalls, wenn auch mit geringerer Geschwindigkeit umgesetzt. Die Michaeliskonstanten der G1PK für die verschiedenen Nucleosid-Triphosphate sind abhängig von der G1P-Konzentration und vom pH. Unter den standardisierten Bedingungen der kinetischen Substratbestimmung kommt diesen Eigenschaften der G1PK keine Bedeutung zu. Am Beispiel von ATP wird die Empfindlichkeit der Methode demonstriert. Ohne besonderen Aufwand erlaubt sie Konzentrationsmessungen im Bereich von 10^-12 Mol/ml. Möglichkeiten für eine Steigerung der Empfindlichkeit und für die Anwendung der Methode zur Bestimmung weiterer Substrate werden aufgezeigt.

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