Gas Chromatographic On‐Column Methylation Technique for the Simultaneous Determination of Antiepileptic Drugs in Blood

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Abstract
Summary An on-column methylation technique (OCMT) is described for th e simultaneous, gas chromatographic determination in blood of ethosuximide (ES), phenobarbital (PB), primidone (PD), phenytoin (DPH), and 5-ethyl-5-phenylhydantoin (EPH). Multiple internal standards are employed in the OCMT, in order to eliminate or to minimize greatly error sources common to t h e technology of gas chromatography and to compensate for the different chemical dispositions of the antiepileptic drugs in an OCMT. The internal standards used in t h e OCMT were as follows: α,α,β-trimethylsuccinimide (TMS) was used for the determination of ES; 5-ethyl-5-para.–tolylbarbituric acid (MPB), for PB: 5-ethyl-5-(para-tolyl) hexahydropyrimidine-4,6-dione (MPD), for PD; and 5 - (para-tolyl) - 5- phenylhy dantoin (MPPH), for EPH and DPH. The use of ether. the buffering of the plasma sample at pH 7.6, and the use of dilute (0.30-0.35 M) trimethylphenylammonium hydroxide (TMPAH) contributed to the specificity of the extraction scheme of the OCMT. The precision and accuracy of the OCMT was attributed to the use of appropriate, multiple internal standards. A method is described for the preparation of standard solutions of drugs in blank plasma (biological matrix) and for the use of the standards in calibration and daily intra-laboratory control of the OCMT. RÉSUMÉ On décrit une technique de méthylation sur colonne (OCMT) pour la détermination simultanée dans la sang de l'ethosuximide (ES), phenobarbital (PB), primidone (PD), phenytoine (DPH), et 5-ethyl-5-phenyl-hydantoine (EPH). De multiples standards internes sont employés pour éliminer ou minimiser de facon importante les différentes sources d'erreurs propres à la technique de chromatographic gazeuse et pour compenser les différentes dispositions chimiques des substances antiépileptiques dans une OCMT. Les standards internes utilisés dans la OCMT étaient les suivants: l'α, α, β-Trimethylsuccimide est utilisé pour doser le ES; l'acide 5-éthyl-5-(para-tolyl) barbiturique. pour le PB; le 5-ethyl-5-(pora-tolyl) hexa-hydropyrimidine-4, 6-dione, pour le PD et le 5-(para-tolyl)-5-phenylhydantoine pour le EPH et le DPH. l'emploi de léther, l'ajustement des échantillons plasmatiques au pH 7.6 et l'utilisation d'une dilution de 0.30-0.35 M trimethylphenylammonium hydroxide (TMPAH) contribuent à la spécificité de l'extraction de la technique. La précision de l'OCMT est due a l'emploi approprié de multiples standards internes. Une méthode est décrite pour la préparation des solutions standards dans du plasma et pour l'utilisation de ces standards dans l'étalonnage et le contrdle journalier intra-laboratoire de l'OCMT. RESUMEN Para la determinacyón simultánea en sangre de etosuximida (ES) fenobarbital (PB), primidona (PD), fenitoina (DPH) y 5-etil-5-fenilhidantoina (EPH) mediante cromatograffa de gases, se describe una tecnica de metilaci6n en columna (OCMT). En la OCMT se emplean múltiples estandards internos para eliminar o reducir al maximo las fuentes de error frecuentes en la cromatograffa de gases y para compensar las diver-sas disposiciones quimicas de las drogas antiepilep-ticas en la OCMT. Los estandards internos utilizados en la OCMT fueron: la α, α, β-TrimetiIsuccimmida se utilizeoa para la determinacyón de ES; el acido 5-etil-5-(para-tolil) barbitúrico para el PB; la 5-etil-5-(para-tolil) exahidropropirimidina-4, 6-diona para la PD; y la 5-(para-tolil)-5-fenilhidantoina para la EPH y DPH. La utilizacion de eter y un buffer para alzanzar un pH de 7.6 en la muestra de plasma y el uso de hidróxido de trimetilfenilamonio (TMPAH) contribuyerón al esquema de extraccitin de la OCMT. La precisión de la OCMT se atribuyó al uso de multiples estandards internos apropiados. Se describe un método para la preparación de soluciones estandard de las drogas en el plasma puro (matriz boilógica), para el uso de los estandards en la calibración y para el control diario intra-laboratórico de la OCMT. ZUSAMMENFASSUNG Beschreibung einer Methylierungstechnik auf der Säule (OCMT) für simultane gaschromatographische Bestimmungen der Blutspiegel von Ethosuximid (ES), Phenobarbital (PB), Primidon (PD), Phenytoin (DPH), und 5-Ethyl-5-Phenylhydantoin (EPH). Es werden mehrere innere Standards in der OCMT angewandt, um die Fehlerquellen zu eliminieren oder weitgehend auszuschalten, die der gaschromatographischen Technik innewohnen und um die unterschiedliche chemische Verteilung der Antiepileptika bei der OCMT zu berücksichtigen. Folgende interne Standards wurden bei der OCMT benützt: α, α, β-Trimethyl-succinimid für die Bestimmung des ES, 5-Ethyl-5-(Para-Tolyl) Barbitursaure für PB, 5-Ethyl-5-(Para-Tolyl) Hexahydropyrimidin-4, 6-Dion für PD und 5-(Para-Tolyl)-5-Pheny)hydantoin für EPH und DPH. Die Verwendung von Äther und die Pufferung des Plasmas bei pH 7.6 sowie die Benutzung verdünnten Trimethylphenylammoniumhydroxyds (TMPSH, 0.30-0.35 M) erhöhte die Spezifizität des Extraktionsvorgangs bei der OCMT. Die Genauigkeit der OCMT wurde auf die Anwendung geeigneter multipler innerer Standards zurückgeführt. Es wird eine Methode beschrieben für die Präparation der Standardlösungen der Medikamente im Leerwert (biologische Matrix) und für die Verwendung der Standards zur Eichung und täglichen Kontrolle der OCMT innerhalb eines Labors.