Hemolysin from listeria — Biochemistry, genetics and function in pathogenesis

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Abstract
Thiol-activated hemolysins (listeriolysins) fromListeria monocytogenes (Sv4b) andListeria ivanovii were purified to homogeneity. The N-terminal amino acid sequences of the 58 kDa listeriolysin ofL. ivanovii and of a 24 kDa protein which may represent the CAMP-factor ofL. ivanovii were determined. Antibodies raised against theL. ivanovii listeriolysin and anti-streptolysin O antibodies were used in Western blot analyses to detect listeriolysin(s) in virulent and avirulent Listeria strains. It was found that all virulent strains ofL. monocytogenes synthesize and secrete listeriolysin (Mr 58–59 kDa), albeit in significantly variable quantities. No protein cross-reaction with anti-listeriolysin antibodies or anti-streptolysin O-antibodies was present in the supernatant ofListeria innocua, Listeria welshimeri, Listeria grayi andListeria murrayi strains. Furthermore, the avirulent but hemolyticListeria seeligeri did not cross-react with these antibodies. In aL. monocytogenes (strain EGD) gene bank constructed inEscherichia coli two types of hemolytic clones were identified. The first type carried recombinant plasmids with a common 2.0 kb fragment coding for a 23 kDa protein. This hemolytic activity was not activated by DTT and the 23 kDa protein did not cross react with anti-listeriolysin or anti-streptolysin antibodies. The other type of hemolytic clones was detected by using anti-streptolysin O antibodies to screen the gene bank. Some of these clones synthesized a protein of 61 kDa which cross reacted with anti-streptolysin O (or anti-listeriolysin) antibodies. By transposon Tn916 mutagenesis ofL. monocytogenes two types of nonhemolytic mutants were obtained. Type I produced no extracellular protein that cross reacted with anti-listeriolysin (or anti SLO) antibodies. Instead of the 58 kDa listeriolysin protein, type II mutants released proteins which were smaller in size than listeriolysin and cross reacted with anti-SLO. These proteins probably represent truncated listeriolysins. Virulence tests in a mouse model indicated that non-hemolytic mutants ofL. monocytogenes were avirulent. Furthermore, it was shown that these nonhemolytic mutants were unable to survive in mouse peritoneal macrophages but were still capable of entering mouse embryo fibroblast (3T6) cells. All virulentL. monocytogenes produced a quantitatively abundant extracellular protein of Mr 60 kDa. We isolated mutants which were still hemolytic but produced significantly reduced amounts of this protein. The ability of these mutants to enter 3T6 cells was severely impaired. SH-aktivierbare Hämolysine (Cytolysine) ausListeria monocytogenes (Sv4b) undListeria ivanovii wurden zur Homogenität gereinigt. Die N-terminalen Aminosäuresequenzen des 58 kDa großen Listeriolysins ausL. ivanovii und eines 24 kDa Protein, das vermutlich der CAMP-Faktor vonL. ivanovii ist, wurden bestimmt. Mit Hilfe von Antikörpern gegen Listeriolysin ausL. ivanovii und Streptolysin O wurden im Western Blot virulente und avirulente Listerienstämme auf ihre Fähigkeit, Listeriolysin zu bilden, getestet. Danach synthetisieren und scheiden alle virulenten Stämme vonL. monocytogenes Listeriolysin (Mr 58–59 kDa) aus, allerdings in sehr unterschiedlicher Menge. In den Kulturüberständen vonListeria innocua, Listeria welshimeri, Listeria grayi undListeria murrayi konnte kein mit Listeriolysin- oder Streptolysin-O-Antikörpern kreuzreagierendes Protein nachgewiesen werden. Die avirulente, aber hämolytische ArtListeria seeligeri zeigte ebenfalls keine Kreuzreaktion mit diesen Antikörpern. Zwei Typen von hämolytischenEscherichia coli Klonen wurden in einer Genbank vonL. monocytogenes (Stamm EGD) nachgewiesen. Der erste Typ besaß rekombinante Plasmide, die ein gemeinsames Fragment von 2 kb trugen. Dieses kodierte für ein Protein von 23 kDa, das für die hämolytische Aktivität verantwortlich ist. Diese Aktivität wurde weder mit DTT aktiviert, noch kreuzreagierte das 23-kDa-Protein mit Antikörpern gegen Listeriolysin oder Streptolysin O. Der andere Typ von hämolytischen Klonen wurde in der Genbank mit Hilfe von Streptolysin-O-Antikörpern identifiziert. Einige dieser Klone synthetisierten ein Protein von 61 kDa, das mit Antikörpern gegen Streptolysin O (oder Listeriolysin) kreuzreagierte. Durch Transposonmutagenese vonL. monocytogenes mit Tn916 wurden 2 Typen von nichthämolytischen Mutanten erhalten. Mutanten des Typs I produzierten kein extrazelluläres Protein, das mit Antikörpern gegen Listeriolysin kreuzreagierte. Typ-II-Mutanten schieden anstelle des 58 kDa Listeriolysins Proteine mit geringerer Größe als Listeriolysin aus, die noch mit diesen Antikörpern reagierten und somit wahrscheinlich verkürzte Listeriolysinproteine darstellen. Tests auf Virulenz in einem Mausmodell zeigten, daß beide Typen von nichthämolytischen Mutanten avirulent sind. Weiterhin konnte gezeigt werden, daß diese nichthämolytischen Mutanten nicht mehr in der Lage sind, in peritonealen Mausmakrophagen zu überleben, jedoch noch in embryonale Mäusefibroblasten...