Antigenic and molecular characterization of isolates of the Italy 02 infectious bronchitis virus genotype

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Abstract
As part of an epidemiological surveillance of infectious bronchitis virus (IBV) in Spain, four Spanish field isolates showed high S1 spike sequence similarities with an IBV sequence from the GenBank database named Italy 02. Given that little was known about this new emergent IBV strain we have characterized the four isolates by sequencing the entire S1 part of the spike protein gene and have compared them with many reference IBV serotypes. In addition, cross-virus neutralization assays were conducted with the main IBV serotypes present in Europe. The four Spanish field strains and the Italy 02 S1 sequence from the NCBI database were established as a new genotype that showed maximum amino acid identities with the 4/91 serotype (81.7% to 83.7%), the D274 group that included D207, D274 and D3896 strains (79.8% to 81.7%), and the B1648 serotype (79.3% to 80%). Furthermore, on the basis of these results, it was demonstrated that the Italy 02 genotype had been circulating in Spain since as early as 1997. Based on the average ratio of synonymous:non-synonymous (dS/dN) amino acid substitutions within Italy 02 sequences, no positive selection pressures were related with changes observed in the S1 gene. Moreover, phylogenetic analysis of the S1 gene suggested that the Italy 02 genotype has undergone a recombination event. Virus neutralization assays demonstrated that little antigenic relatedness (less than 35%) exists between Italy 02 and some of the reference IBV serotypes, and indicated that Italy 02 is likely to be a new serotype. Caractérisation antigénique et moléculaire des souches de virus de la bronchite infectieuse de génotype Italy 02 Lors d'une étude épidémiologique de virus de la bronchite infectieuse en Espagne, quatre souches espagnoles isolées sur le terrain ont montré de très fortes similitudes au niveau de la séquence de la spicule S1 avec la séquence d'un IBV nommé Italy 02, obtenue dans la base de données de GenBank. Etant donné que l'on connaît peu de chose sur cette nouvelle souche émergente d'IBV, nous avons caractérisé les quatre souches par séquençage de la totalité de la partie S1 du gène de la protéine de spicule et nous les avons comparées à de nombreux sérotypes d'IBV de référence. De plus, des essais de séroneutralisations croisées (VN) ont été réalisés avec les principaux sérotypes d'IBV présents en Europe. Il a été établi que les quatre souches espagnoles du terrain et de la souche Italy 02 dont la séquence de S1 a été obtenue auprès de la base de données du NCBI, représentaient un nouveau génotype qui avait un maximum d'identité en acides aminés avec le sérotype 4/91 (81,7–83,7%), le groupe D274 incluant les souches D207, D274 et D3896 (79,8–81,7%), et le sérotype B1648 (79,3%-80%). De plus, sur la base de ces résultats, il a été démontré que le génotype Italy 02 a circulé en Espagne dès 1997. En se basant sur le rapport moyen des substitutions en acides aminés synonymes : non-synonymes (dS/dN) au sein des séquences des souches de type Italy 02, aucune pression de sélection positive n'était associée aux changements observés au niveau du gène S1. De plus, l'analyse phylogénétique du gène S1 suggère que le génotype Italy 02 a subi un évènement de recombinaison. Les essais de neutralisation ont montré qu'une relation antigénique faible (moins de 35%) existe entre les sérotypes Italy 02 et quelques souches d'IBV de référence, et indiquaient que la souche Italy 02 représente probablement un nouveau sérotype. Antigenetische und molekulare Charakterisierung von Isolaten des Italien 02-Genotyps des Virus der infektiösen Bronchitis Im Rahmen einer Überwachungsstudie zum Vorkommen des Virus der infektiösen Bronchitis (IBV) in Spanien zeigten vier spanische Feldisolate große Übereinstimmung der S1-Spikesequenz mit einer IBV-Sequenz aus der Gendatenbank namens Italien 02. Da wenig über diesen neuen IBV-Stamm bekannt war, haben wir die vier Isolate mittels Sequenzierung des gesamten S1-Teils des Spikeprotein-Gens charakterisiert und sie mit vielen IBV-Referenzserotypen verglichen. Außerdem wurden mit den Haupt-IBV-Serotypen in Europa Kreuzvirusneutralisationstests (VN) durchgeführt. Die vier spanischen Feldisolate und die S1-Sequenz des Italien 02-Stamms aus der NCBI-Datenbank wurden als zu einem neuen Genotyp gehörend eingeordnet. Dieser wies mit dem 4/91-Serotyp eine maximale Aminosäurenübereinstimmung von 81,7–83,7 %, mit der D274-Gruppe, zu der die Stämme D207, D274 und D3896 gehören, von 79,8–81,7 % und mit dem B1648-Serotyp von 79,3–80 % auf. Weiterhin wurde auf der Basis dieser Ergebnisse festgestellt, dass der Italien 02-Genotyp seit 1997 in Spanien zirkuliert. Basierend auf dem mittleren Verhältnis von übereinstimmenden zu nicht übereinstimmeneden (dS/dN) Aminosäurensubstitutionen innerhalb der Italien 02-Sequenz konnte kein Zusammenhang zwischen einem verstärkten Selektionsdruck und den beobachteten Veränderungen im S1-Gen hergestellt werden. Überdies legte die phylogenetische Analyse des S1-Gens nahe, dass der Italien 02-Genotyp eine Rekombination erfahren hat. Die VN-Tests ließen eine nur geringe antigenetische Verwandtschaft (S/dN) , no se estableció ninguna relación entre presiones selectivas positivas y los cambios observados en el gen S1. Además, los estudios filogenéticos del gen S1 sugirieron que el genotipo Italy 02 ha sufrido un proceso de recombinación. Los estudios de neutralización viral demostraron que existe una baja relación antigénica (menos de 35%) entre Italy 02 y algunos de los serotipos de referencia de IBV, e indicaron que Italy 02 es probablemente un nuevo serotipo.