Neuere Untersuchungen zur Bindung von Ethidiumbromid an DNA 1. Mitteilung: Gleichgewichtsmodell, Bindungsenthalpien und Entropien für die kompetitive und nicht‐kompetitive Bindung

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Abstract
Die Bindung des Farbstoffs Ethidiumbromid (E) an Kalbsthymus‐DNA wurde absorptionsspektroskopisch untersucht. Die Menge gebundenen Farbstoffs pro Mononucleotideinheit wurde in Tris‐Puffer als Funktion der Konzentration an NaCl, KCl, MgCl2 und der Temperatur gemessen. Die Messungen haben wir auf den Bereich sehr verdünnter Farbstofflösungen beschränkt, in dem kooperative Effekte vernachlässigbar sind. Die Scatchard‐Isothermen sind in diesem Bereich linear. Die mittlere Zahl von Bindungspositionen pro Mononucleotideinheit beträgt n = 0,21. Sie ist von Art und Konzentration zugesetzter Salze und von der Temperatur unabhängig. Sie stimmt mit dem Wert überein, der durch Titration von E mit DNA bestimmt wurde. – Die formale Scatchard‐Bindungskonstante Ks hängt stark von Art und Konzentration der zugesetzten Salze und von der Temperatur ab. Zur Beschreibung der Salzabhängigkeit wird ein Gleichgewichtsmodell für die Bindung von E an DNA angegeben. Drei Gleichgewichte haben wir berücksichtigt: 1. Nicht‐kompetitive Bindung 1 des Farbstoffs an nt Bindungspositionen mit der Gleichgewichtskonstanten Ks1 Die nicht‐kompetitive Bindung wird in der Literatur als Intercalation beschrieben. 2. Kompetitive Bindung 2 des Farbstoffs an n2 Bindungspositionen mit der Gleichgewichtskonstanten Ks2 und einem Metallkation als Kompetitor. 3. Kompetitive Bindung 3 des Metallkations an n2 Bindungspositionen mit der Gleichgewichtskonstanten Ks3 und dem Farbstoff als Kompetitor. Im allgemeinen wird die kompetitive Bindung auf die elektrostatische Wechselwirkung zwischen den Ethidium‐ bzw. Metallkationen und den anionischen Phosphodiesterresten der DNA zurückgeführt. – Die Experimente stehen mit dem Gleichgewichtsmodell in voller übereinstimmung, wenn man n1 = n2 = n setzt. Ks1 und Ks2 sind erwartungsgemäß von Salzzusätzen unabhängig. Unter Standardbedingungen beträgt im Mittel Ks1 = 1,1 404 und Ks2 = 5,6‐105 m−1 (Tab. 1). Im Gegensatz zu Literaturangaben ist damit Bindung 1 ungünstiger als Bindung 2. Ks1 hängt stark von der Natur des Metallkations ab und spiegelt die individuellen Salzeigenschaften wider (Tab. 1). – Aus der Temperaturabhängigkeit der drei Bindungskonstanten Ks1, Ks2 und Ks3 sind die Bindungsenthalpien δHosi, und die Bindungsentropien ΔSosi (i = 1,2,3) zugänglich (Tab. 4). Die Bindungsenthalpien für die Bindung 1 und 2 unterscheiden sich nur sehr wenig. Sie betragen ΔHos1ΔHos2 ≈︁−28 kj mol−1 Die Bindungsentropie ist für Bindung 1 negativ, für Bindung 2 positiv. Deshalb ist Bindung 2 thermodynamisch gegenüber 1 bevorzugt Die Enthalpien für die Bindung 3 der Metallkationen an DNA sind für alle untersuchten Salze nahezu null. Die Entropien sind positiv. Die Bindung 3 ist damit vorzugsweise ein entropischer Effekt. – Es gibt verschiedene Möglichkeiten, die Bindungspositionen in der DNA zu zählen. Die Zählweise geht in die Bindungsentropie, nicht in die Enthalpie ein. Die Zählung der Bindungspositionen nach dem nearest neighbour exclusion‐Modell von Crothers et al. läßt für den nichtkooperativen Bereich n = 1/6 erwarten. Der Wert stimmt mit dem Experiment nur grob überein.