Fluorescence assay for the detection of adherent Candida yeasts to target cells in microtest plates

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Abstract
Summary. We describe an assay based on photometric analysis for the measurement of adherence of Candida species to epithelial target cells (Vero cell line). Adherent Candida cells were detected by staining the cells with the fluorescent dye Calcofluor white (CFW), which binds to chitin and glucan in the yeasts. The tests were performed on microtest plates, which were analysed automatically by fluorescence plate readers. The assay is based on the following steps: (i) coating of the microtest plates with target cells (e.g. Vero cells); (ii) infection with Candida: (iii) staining of Candida with CFW; (iv) rinsing to remove non‐adherent Candida cells and unbound dye; (v) detection of adherent fluorescent Candida cells. The test was able to detect 4times104 cells ml‐1. The standard deviation was ±8%. Day‐to‐day variation was ± 10% at most. The adherence of strains of different Candida species was assayed by a standard procedure. The results confirmed the order of adherence, with C. albicans ranking first, followed by C. tropicalis, C. parapsilosis and C. glabrata.Zusammenfassung. Ein photometrischer Test zur Messung der Adhärenz von Candida‐Species an epithelialen Zielzellen (Vero‐Zellen) wird beschrieben. Adhärente Candida Zellen werden mit Hilfe des Fluoreszenz‐Farbstoffes Calcofluor Weiβ (CFW), der an Chitin und Glucan bindet, nach‐gewiesen. Der Test Kann in Mikrotestplatten durchgeührt werden und mittels automati‐scher Fluoreszenz‐Plattenphotometer ausgewertet werden. Er umfaßt die folgenden Schritte: (i) Beschichtung der Mikrotestplatte mit Zielzellen (Vero‐Zellen); (ii) Infektion mit Candida; (iii) Färbung der Candida‐Zellen mit CFW; (iv) Ent‐fernung nicht‐adhärenter Candida‐Zellen und ungebundener Farbe; (v) Nachweis adhärenter fluoreszierender Candida‐Zellen. Mit dem Test ist es möglich, bis zu 4times 104 eingesetzter Hefen pro Milliliter nachzuweisen. Die üiblichen Testpara‐meter wurden bestimmt. Die Standardabweichung lag bei ±8%. Die Schwankungen von Tag zu Tag lagen bei maximal ±10%. Der Test wurde auf eine Reihe von Stämmen verschiedener Candida‐Species angewandt Die Ergebnisse bestätigen die Rangordnung der Adhärenz, mit C. albicans an erster Stelle, gefolgt von C. tropicalis, C. parapsilosis und C. glabrata.