Methods to purify and determine rubratoxins

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Abstract
Aus Kulturen vonPenicillium rubrum auf natürlichen Nährböden, einem halbsynthetischen Medium und auf einem Medium von Glucose und Salzen konnten die Rubratoxine gewonnen werden. Die Rubratoxin enthaltenden Nährböden wurden mitfolgenden Lösungsmitteln extrahiert: Diäthyläther, Äthylacetat-Benzol, Äthylalkohol (100%), Äthylalkohol-Aceton, Aceton, Acetonitril oder Diäthyläther unter Rückfluß bei 45° C. Alle Auszüge wurden durch Dünnschichtchromatographie überprüft. Etliche Auszüge wurden auf einer mit Kieselsäure gefüllten Säule gereinigt und mit Aceton eluiert. Andere Extrakte wurden nach Entfernung der Pigmente an einer Silica-Celite-Kolonne gereinigt und schließlich mit Gradienten-Lösungsmittel eluiert. Die Ausbeuten von Rubratoxin B (1,9 mg/g oder 0,77 mg/ml) waren am größten, wenn entweder Mais, Reis oder das Medium aus Glucose und Salzen nacheinander mit Diäthyläther, Äthylacetat-Benzol und Diäthyläther extrahiert wurden. Besonders große Ausbeute gab es, wenn die Proben auf pH 1,5 gebracht wurden und dann mit Diäthyläther am Rückfluß für 1–4 Std bei 45° C behandelt wurden. Die Ausbeuten an Rubratoxin A (1,0 mg/g oder 0,1–0,15 mg/ml) waren am größten, wenn Maisproben zweimal mit Äthylalkohol, Aceton und Äthylacetat extrahiert wurden. Große Ausbeuten gab es auch, wenn ein Medium aus Glucose und Salzen mit Diäthyläther oder wenn ein Medium aus Hefeextrakt und Saccharose 4 Std mit Diäthyläther am Rückfluß extrahiert wurde. Große Mengen von ziemlich reinem Rubratoxin A (bis auf 400 mg) und Rubratoxin B (mehr als 1 g) erhielt man, wenn Säulenchromatographie und präparative Dünnschichtchromatographie zusammen gebraucht wurden. Rubratoxins were recovered from cultures ofPenicillium rubrum after the mold grew in natural substrates, a semi-synthetic medium, and a glucose-mineral salts broth. Substrates that contained rubratoxins were extracted with: diethyl ether, ethyl acetate-benzene, ethanol (100%), ethanol-acetone, acetonitrile, or diethyl ether with refluxing at 45° C. Extracts were screened for rubratoxins by thin-layer chromatography. Some extracts were partially purified with a column of silicic acid using acetone as the eluant. Other extracts were purified (primarily removal of pigments) using columns of silica gel plus Celite and gradient solvent elution. Most rubratoxin B (1.9 mg/g or 0.77 mg/ml) was recovered when corn, rice, or glucose-salts broth were extracted successively with diethyl ether, ethyl acetate-benzene, and diethyl ether or when samples were adjusted to pH 1.5 before refluxing with diethyl ether at 45° C for 1–4 h. Most rubratoxin A (0.1–0.15 mg/ml or 1.0 mg/g) was obtained from samples of corn extracted twice each with ethyl alcohol, acetone, and ethyl acetate; from glucose-mineral salts broth extracted with diethyl ether; or from yeast extract sucrose broth extracted with diethyl ether and refluxed for 4 h at 45° C. Large amounts of fairly pure rubratoxin A (up to 400 mg) and rubratoxin B (> 1g) were obtained with a combination of preparative thin-layer and column chromatography.