Enzymatic characterization of lysosome equivalents (spherosomes) in corn seedlings

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Abstract
The following acid hydrolases are partially sedimentable from cell-free extracts of corn seedlings: protease (pH-optimum 4,2), phosphatase (pH-optimum 5,0 and 6,5), unspecific esterase (pH-optimum 5,2), RNase (pH-optimum 6,5), arylsulphatase-C (pH-optimum 5,0) and α- and β-amylase (pH-optimum 7,0 and 5,0 respectively). After differential centrifugation of cell-free extracts the sedimentable hydrolases are recovered mainly in the mitochondrial and microsomal fraction. It could be demonstrated that the acid hydrolases protease, phosphatase, RNase, and esterase of the mitochondrial fraction are contained in membrane-bound particles. Isopycnic centrifugation of cell-free extracts in sucrose gradients revealed the presence of three particulate fractions carrying hydrolases. The heaviest fraction has a relative density of 1,138 g\sdcm-3 and contains acid protease,-phosphatase,-RNase, and acid esterase. A lighter fraction (d=1,105 g\sdcm-3) contains the same acid hydrolases. The specifically lightest cell fraction (d=1,070 g\sdcm-3) contains the acid hydrolases glucose-6-phosphatase, arylsulphatase-C and small amounts of \ga- and \gb-amylase activity. This fraction also contains NADH-diaphorase activity. By means of enzymatic characterization and staining with fluorochromes the structures carrying hydrolases were identified as two kinds of spherosomes and as fragments of the endoplasmatic reticulum. From these results it is concluded that the spherosomes represent organelles equivalent to the lysosomes of animal cells. β-Glucuronidase, phospholipase-C, lipase, and arylsulphatase A and-B, all of with are typical enzymes of animal lysosomes, are completely absent in cell-free extracts of corn seedlings. The isolated spherosomes do not exhibit indophenoloxydase activity; thus the histochemical demonstration of this enzyme in spherosomes must be considered to be an artifact. Isolated lipid droplets, spherosomes, prospherosomes, and mitochondria incorporate H-3-acetate into lipids. Consequently they contain all the nessesary enzymes for lipid synthesis. The high activity of lipid synthesis in the spheroromes points to a possible conversion of these organelles into lipid bodies. Two transaminases are partially bound to the mitochondria; the rest of the activity is probably bound to fragments of membranes less dense than an 18% sucrose solution. Aus zellfreien Extrakten von Maiskeimlingen konnten folgende sauren Hydrolasen teilweise sedimentiert werden: Protease (pH 4,2), Phosphatase (pH 5,0 und pH 6,5), unspezifische Esterase (pH 5,2), RNase (pH 6,5), Arylsulfatase-C (pH 5,0) und α- und β-Amylase (pH 7,0 bzw. 5,0). Durch differentielle Zentrifugation konnte gezeigt werden, daβ die sedimentierbaren Hydrolasen vorwiegend in der Mitochondrien- und Mikrosomenfraktion vorliegen. Auf verschiedene Weise konnte gezeigt werden, daβ die sauren Hydrolasen der Mitochondrienfraktion: Protease, Phosphatase, Esterase und RNase, in membranumschlossenen Zellpartikel verpackt vorliegen. Durch Fraktionierung des zellfreien Extraktes von Maiskeimlingen in Dichtegradienten von Saccharose gelang es, drei hydrolasentragende Zellfraktionen zu isolieren: die schwerste Fraktion weist eine relative Dichte von 1,138 g·cm-3 auf und enthält saure Protease, saure Phosphatase, saure Esterase und saure RNase. Eine leichtere Fraktion weist eine spezifische Di hte von 1.105 g·cm-3 auf und enthällt dieselben sauren Hydrolasen. Die spezifisch leichteste Zellfraktion enthält die sauren Hydrolasen: Glucose-6-Phosphatase, Arylsulfatase-C und Teile der α- und β-Amylase. Überdies enthält sie die Oxydoreductase: NADH-Diaphorase. Mittels Fluorochromierung und enzymatischer Charakterisierung wurden diese hydrolasentragenden Zellstrukturen identifiziert: die schwerste Fraktion besteht vorwiegend aus den Prosphärosomen; die leichtere aus den Sphärosomen und die spezifisch leichteste aus Membranen des Endoplasmatischen Reticulums. Aus diesen Befunden wird geschlossen, daß die Prosphärosomen und Sphärosomen Äquivalente der tierischen Lysosomen darstellen. In zellfreien Extrakten von Maiskeimlingen sind die für tierische Lysosomen charakteristischen Enzyme β-Glucuronidase, Phospholipase C, Lipase und Arylsulfatase A und B nicht nachzuweisen. Die Sphärosomen weisen keine enzymatische Indophenoloxydaseaktivität auf. Isolierte Lipidkörperchen, Sphärosomen, Prosphärosomen und Mitochondrien bauen H3-Acetat in Lipid ein; sie enthalten daher sämtliche zur Synthese von Lipid notwendigen Enzyme. Die Transaminasen sind teilweise an die Mitochondrien gebunden; die restliche Aktivität ist wahrscheinlich an Membranfragmente gebunden, die leichter als 18% Saccharose sind.