The Micro‐ELISA for Antibodies to Trichinella spiralis: Elimination of False Positive Reactions by Antigen Fractionation and Technical Improvements

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Abstract
Summary: In order to improve the specificity of the micro ELISA for determination of the presence of antibody to Trichinella spiralis, soluble antigen prepared from homogenised T. spiralis larvae was passed through a Sephadex G‐200 column. Most of the protein was eluted between tubes 20—100, which were then individually tested by micro ELISA. The contents of two groups of tubes subsequently designated F 30 and F 50 respectively were found to react most to a known positive serum, but the differentiation between positive and negative sera was greater with F 50.Five known false positive sera were then used to find the optimum combination of three antigens (F 30, F 50 and crude antigen), two different preparations of horseradish peroxidase linked anti‐swine IgG (C 1 and C 2), two serum diluents (D 1 and D 2) and two methods of substrate production (S 1 and S 2). The lowest readings obtained for the false positive sera, which were close to that of the known negative serum were achieved with the combination of F 50, C 2, (a commercial anti‐swine IgG), D 2 (PBS 7.2 including 0.5 M NaCl) and S 2 (substrate purified by recrystallisation). This conclusion was then further verified by comparison with the original technique in a micro ELISA of a further one hundred known false positive sera.Zusammenfassung: Ein Mikro‐ELISA für Antikörper gegen Trichinella spiralis: Beseitigung falsch‐positiver Reaktionen durch Antigenfraktionierung und technische VerbesserungenZur Verbesserung der Spezifität des Mikro‐ELISA für die Bestimmung von Trichinella spiralis‐Antikörpern wurde ein lösliches Antigen von homogenisierten T. spiralis‐Larven gewonnen und durch Sephadex G‐200 gereinigt. Das meiste Protein eluierte mit den Proben 20 bis 100, die einzeln im Mikro‐ELISA getestet wurden. Die Proben von zwei Gruppen von Röhrchen, die mit F 30 und F 50 bezeichnet wurden, reagierten am besten mit einem bekannten, positiven Serum, die Differenzierung zwischen positiven und negativen Seren jedoch gelang besser bei Verwendung von F 50.Fünf bekannte falsch‐positive Werte dienten zur Erarbeitung der optimalen Kombination für die drei Antigene (F 30, F 50 und ungereinigtes Antigen) und zwei verschiedene Präparationen von Meerrettich‐Peroxidase‐mar‐kiertem Anti‐Schweine IgG (C 1 und C 2) sowie zwei Serumverdünnungsflüssigkeiten (D 1 und D 2) und zwei Methoden der Substratzubereitung (S 1 und S 2). Die niedrigsten Werte für falsch‐positive Seren, die in etwa dem Wert eines bekannten negativen Serums entsprachen, ließen sich durch eine Kombination von F 50, C 2 (ein kommerzielles Anti‐Schweine IgG), D 2 (PBS 7,2 mit 0,5 M NaCl) und S 2 (Substrat durch Rekristallisierung gereinigt) erzielen. Diese Ergebnisse wurdenn durch Vergleiche mit der Originaltechik in einem Mikro‐ELISA mit weiteren 100 bekannten falsch‐positiven Seren bestätigt.Résumé: Un micro‐test ELISA pour des anticorps anti‐Trichinella spiralis: Suppression des réactions faussement positives par un fractionnement de l'antigène et une amélioration techniqueOn a produit un antigène soluble à partir de larves homogénéisées de T. spiralis qui a été purifié par Sephadex G‐200 pour améliorer la spécificity d'un micro‐ELISA pour la détermination d'anticorps anti‐T. spiralis. La plus grande partie de protéine fut élevée avec les échantillons micro‐ELISA. Les échantillons de deux groupes de tubes, désignés par F 30 et F 50, ont réagi le mieux avec un sérum positif connu. L'utilisation de F 50 a permis cependant une meilleure différenciation entre des sérums positifs et négatifs.Cinq valeurs faussement positives connues, deux préparations différentes d'anti‐IgG de porcs marqués à la peroxydase du raifort (C 1 et C 2) deux solutions de dilution des sérums (D 1 et D 2) et deux méthodes de préparation du substrat (S 1 et S 2) ont servi à l'élaboration de la combinaison optimale pour les trois anticènes (F 30, F 50 et antigène non purifié). Les valeurs les plus basses pour des sérums faussement positifs correspondant à peu près à la valeur d'un sérum négativ connu ont été obtenues en combinant F 50, C 2 (une IgG antiporc du commerce), D 2 (PBS 7,2 avec 0,5 M NaCl) et S 2 (substrat purifié par recristallinisation). Ces résultats ont été confirmés par comparaison avec la technique originale dans un micro‐test ELISA avec 100 autres sérums faussement positifs connus.Resumen: Una micro‐ELISA para anticuerpos frente a Trichinella spiralis: Eliminación de reacciones falsamente positivas mediante fraccionamiento del antígeno y mejoras técnicasPara mejorar la especificidad de la prueba micro‐ELISA destinada a determinar los anticuerpos anti‐Trichinella spiralis, se obtuvo un antígeno soluble de larvas homogeinizadas de T. spiralis, el cual se purificó a través de Sephadex G‐200. La parte mayor de proteína fué eluída con las muestras 20 hasta 100, que se examinaron individualmente en la micro‐ELISA. Las muestras de dos grupos de tubitos, designados como F 30 y F 50, reaccionaron como las mejores con un suero positivo conocido, mas la diferenciación entre sueros positivos y negativos se logró mejor empleando F 50.Cinco valores falsamente positivos conocidos sirvieron para elaborar la combinación óptima para los tres antígenos (F 30, F 50 y un antígeno no purificado) y dos preparaciones diferentes de anti‐globulinas IgG de cerdo marcadas con peroxidasa de ríbano rusticano (CI y C 2) asf como dos soluciones para diluir el suero (D 1 y D 2) y dos métodos de preparación del substrato (S 1 y S 2). Se lograron los valores más bajos para sueros falsamente positivos, que equivalían más o menos al valor de un suero negativo conocido, mediante la combinación siguiente: F 50, C 2 (una anti‐globulina Ig comercial de cerdo), D 2 (PBS 7,2 con 0,5 M ClNa) y S 2 (substrato purificado por medio de recristalización). Estos resultados se confirmaron recurriendo a comparaciones con la técnica original en una micro‐ELISA con 100 sueros falsamente positivos conocidos más.