Disulphide bonds in wheat gluten: cystine peptides derived from gluten proteins following peptic and thermolytic digestion

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Abstract
Gluten from the wheat variety Rektor was extracted with 70% aqueous ethanol. The insoluble portion (whole glutenin) was partially hydrolysed with trypsin at pH 6.5 and separated on a Sephadex G25 column. The high molecular weight fraction 1 was further hydrolysed with pepsin at pH 2.O. To remove low molecular weight proteins, a portion of whole glutenin was extracted with dilute acetic acid. The residue (enriched glutenin), which contained mostly LMW and HMW subunits of glutenin, was hydrolysed with thermolysin at pH 6.5. The peptic and tryptic hydrolysates were separated on a Sephadex G25 column and the peptide fractions with the highest cystine content were separated further by reversed-phase high-performance liquid chromatography (RP-HPLC). Cystine peptides were detected by differential chromatography (RP-HPLC prior to and after reduction of disulphide bonds) and then isolated by preparative RP-HPLC. After reduction, cysteine peptides were alkylated and analysed for their amino acid sequence. Altogether, 19 cystine peptides were characterized and assigned to known sequences of gluten proteins; 16 peptides confirmed the positions of disulphide bonds present in LMW subunits and γ-gliadins, as described previously. For the first time, a cystine peptide has been isolated, representing an intermolecular disulphide bond between the y-type of HMW and LMW subunits. Furthermore, a cystine peptide was assigned to γ-gliadins; thus, all cysteine residues of γ-gliadins are documented by at least one cystine peptide. One peptide analysed came from the α-amylase inhibitor CM 16. Altogether the results indicate that the intramolecular linkages of gluten proteins are not formed at random, but are strongly directed. For intermolecular linkages, however, different combinations were found. Kleber der Weizensorte Rektor wurde mit 70%igem, wäßrigen Ethanol extrahiert. Der unlösliche Anteil (Gesamtglutenin) wurde mit Trypsin bei pH 6,5 partiell hydrolysiert und das Partialhydrolysat an Sephadex G25 aufgetrennt. Fraktion 1 mit dem höchsten Molekulargewichtsbereich wurde mit Pepsin bei pH 2,0 weiter aufgespalten. Ein Teil von Gesamtglutenin wurde zur Entfernung niedermolekularer Proteinanteile mit verdünnter Essigsäure extrahiert. Der Rückstand (angereichertes Glutenin), der hauptsächlich LMW- und HMW-Untereinheiten enthielt, wurde mit Thermolysin bei pH 6,0 hydrolysiert. Die peptischen und thermolytischen Partialhydrolysate wurden an Sephadex G25 fraktioniert und die Peptidfraktionen mit dem höchsten Cystingehalt mittels Umkehrphasenflüssigchromatographie (RP-HPLC) weiter aufgetrennt. Die Cystinpeptide wurden durch Differenzchromatographie (RP-HPLC vor und nach Reduktion der Disulfidbindungen) detektiert, durch Reduktion in Cysteinpeptide überführt, alkyliert und sequenziert. Insgesamt wurden 19 Cystinpeptide analysiert und bekannten Sequenzen von Kleberproteinen zugeordnet. 16 Peptide bestätigen die in einer früheren Arbeit gefundenen Disulfidbindungen von LMW-Untereinheiten und γ-Gliadinen. Zum ersten Mal wurde ein Cystinpeptid nachgewiesen, das eine intermolekulare Disulfidbindung zwischen HMW-Untereinheiten vom y-Typ und LMW-Untereinheiten repräsentiert. Ein weiteres Cystinpeptid konnte γ-Gliadinen zugeordnet werden, so daß deren Disulfidbindungen nun vollständig erfaßt sind. Ein Cystinpeptid stammt vom α-Amylaseinhibitor CM 16. Die Ergebnisse zeigen insgesamt, daß die intramolekularen Disulfidbindungen der Kleberproteine nicht zufällig verteilt, sondern streng gerichtet angeordnet sind. Bei den intermolekularen Disulfidbindungen können hingegen unterschiedliche Bindungskombinationen auftreten.

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