Multiple Antimicrobial Resistance Region of a Putative Virulence Plasmid from an Escherichia coli Isolate Incriminated in Avian Colibacillosis

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Abstract
Infections due to Escherichia coli have been costly to the poultry industry, but the exact virulence mechanisms used by these organisms to cause disease in birds remain undefined. Several factors have been shown to contribute to the virulence of avian E. coli, and many of the genes encoding these factors have been found on large conjugative plasmids. Because of the occurrence of antimicrobial resistance genes on these same plasmids, it is possible that the use of antimicrobial agents may select for persistence of E. coli containing such plasmids. In the present study, a subclone of one of these plasmids was identified as likely containing some virulence and antimicrobial resistance genes. In an effort to better understand the relationship between virulence and resistance in these plasmids, this subclone was sequenced and the sequence analyzed. Analysis of this 30-kilobase (kb) region of plasmid pTJ100 revealed a mosaic of virulence genes, insertion sequences, antimicrobial resistance cassettes, and their remnants. Many of the resistance genes found in this region were expressed under laboratory conditions, indicating that certain antimicrobial agents, including disinfectants, antibiotics, and heavy metals, could promote selection of E. coli containing such plasmids in the production environment. Also, analysis of the G + C content of this clone indicated that it is the likely consequence of a complex evolution with components derived from various sources. The occurrence of many mobile elements in conjunction with antimicrobial resistance and virulence genes in this 30-kb region may indicate that the genetic constitution of the clone is quite plastic. Although further study will be required to better define this plasmid's role in avian E. coli virulence, the sequence described here is, to our knowledge, the longest known contiguous sequence of a ColV plasmid yet presented. Analysis of this sequence indicates that this clone and its parent plasmid may be important to the pathogenesis of avian colibacillosis and the evolution of avian E. coli virulence. Región de resistencia múltiple a antibióticos de un plásmido putativo de virulencia de una cepa de Escherichia coli incriminada en un brote de colibacilosis. Las infecciones ocasionadas por cepas de Escherichia coli son sumamente costosas para la industria avícola, pero los mecanismos de virulencia utilizados por estos microorganismos en aves permanecen sin ser clarificados. Se ha demostrado que varios factores contribuyen a la virulencia de las cepas aviares de E. coli, y muchos de los genes que condifican por estos factores se encuentran alojados en plásmidos de conjugación de gran tamaño. Debido a que estos plásmidos también codifican por genes de resistencia a antibióticos, es posible que el uso de antibióticos seleccione de manera específica las cepas de E. coli que contienen estos plásmidos, aumentando así la persistencia de las mismas en las parvadas. Se identificó un subclon de uno de estos plásmidos, el cual posiblemente contenía algunos factores de virulencia y genes de resistencia a antibióticos. Se analizó la secuencia de este subclon, en un intento de entender mejor la relación entre los factores de virulencia y los genes de resistencia a antibióticos contenidos en este plásmido. El análisis de secuencia de una región de 30 kilobases del plásmido pTJ100 reveló un mosaico de genes de virulencia, secuencias de inserción, casetes de genes de resistencia a antibióticos y sus remanentes. Muchos de los genes de resistencia encontrados en esta región fueron expresados bajo condiciones de laboratorio, indicando que algunos agentes antimicrobiales, incluyendo desinfectantes, antibióticos y metales pesados, pueden promover la selección de cepas de E. coli que contienen este tipo de plásmido en condiciones de campo. El análisis del contenido de nucleótidos G + C de la secuencia del clon indicó que es probable que los resultados obtenidos sean la consecuencia de proceso evolutivo complejo con en el cual influyeron componentes derivados de varias fuentes. La presencia en esta región de 30 kilobases de varios elementos móviles en compañía de genes de resistencia y factores de virulencia indica que la constitución genética de este plásmido es posiblemente muy flexible. Aunque se requiere de la realización de más estudios para definir mejor el papel de este plásmido en la virulencia de cepas aviares de E. coli, la secuencia descrita en este estudio es, hasta donde sabemos, la secuencia continua de un plásmido del tipo ColV más larga presentada hasta el momento. El análisis de esa secuencia indica que el clon, y el plásmido de donde fue derivado, pueden ser importantes en la patogénesis de la colibacilosis aviar y en la evolución de la virulencia de las cepas aviares de E. coli. Abbreviations: bp = base pair, CFU = colony-forming units, ColV = colicin V, ddH2O = double-distilled water, iss = increased serum survival gene, Iss = protein product of iss, kb = kilobase, LPS = lipopolysaccharide, MIC = minimum inhibitory concentration, NCBI = National Center for Biotechnology Information, ORF = open reading frame, PBS = phosphate-buffered saline, PCR = polymerase chain reaction