Reversed-phase HPLC analysis of peptides in standard and dairy samples using on-line absorbance and post-column OPA-fluorescence detection

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Abstract
Absorbance and post-columno-phthalaldehyde (OPA)-fluorescent detection were used to analyse standard and dairy peptides following reversed-phase HPLC. Using both detection systems on-line provides additional information on the presence of peptides in dairy products. The detection response depends on the amino acid composition of the peptide involved. Among the peptides used, glutathione, lysine-containing peptides and peptides with glycine as the N-terminal residue give the highest fluorescence after the OPA post-column reaction. Absorbance is more sensitive than fluorescence for peptides with aromatic amino acids. Different parameters, such as the flow rate of OPA, the amount of mercaptoethanol in the OPA reagent and the temperature of reaction, substantially influence the fluorescent response of peptides. The interest of using on-line absorbance and fluorescence detection is highlighted by analysing peptides from skim milk and from a tryptic hydrolysate. Der Postkolonnen-Absorptions- und Fluoreszenznachweis mit orthophthaldialdehyd (OPA) wird bei der Standard- und Milchpeptidanalyse nach der Trennung durch Hochleistungs-Flüssigchromatographie (HPLC) eingesetzt. Der Einsatz beider Nachweissysteme vermittelt zusätzliche Information über das Auftreten von Peptiden in Milchprodukten. Das Ergebnis des Nachweisverfahrens ist von der chemischen Bindung der Aminosäuren im Peptid abhängig. Unter den untersuchten Peptiden weisen Glutathion, Peptide mit Lysin und Peptide mit Glykokoll im endständigen N nach der Postkolonnen-Reaktion mit OPA die größte Fluoreszenz auf. Bei Peptiden mit aromatischen Aminosäuren spricht die Absorption stärker als die Fluoreszenz an. Verschiedene Parameter wie die OPA-Strömung, der Anteil an Mercaptoethanol im Reagens OPA und die Reaktionstemperatur beeinflussen die Fluoreszenzcharakteristik des Peptids. Der Einsatz der on-line-Absorption und Fluoreszenz ist nützlich bei der Analyse von Peptiden in entrahmter Milch und eines tryptischen Hydrolysats.

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